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UV, 형광, 광산란 검출기를 이용한 Exosome(EV)의 다면 해석

한국쇼코츠쇼의 'UV, 형광, 광산란 검출기를 이용한 Exosome(EV)의 다면 해석'에 관한 세미나 내용은 다음과 같다.

엑소좀은 세포외 소포, Extracellular Vesicle(EV)라고 불리며 살아는 유기체에서 다양한 정보와 물질을 전달하는 역할을 한다. 이 EV는 매우 민감한 진단 마커 및 치료 응용 분야로서 잠재력을 가지고 있으며 Exosome 안에는 단백질, RNA, DNA를 가지고 있고 표적 세포와 작용할 수 있는 표면을 가지고 있어 치료 약제나 약물 운반인자로의 응용이 가능하다.
이러한 엑소좀을 분석하는 방법은 다양한 방법이 있으나 Shodex에서는 이중 크기 기반 분리법(Size based isolation)을 활용하여 Exosome을 분석하였다.

연구 개발로서의 엑소좀은 나노입자의 혼합물로 취급된다. 따라서 바이오의약품으로의 EV를 제조하기 위해서는 기초연구, 개념증명, 모든 임상 시험단계 및 실제 임상 생산에 걸쳐 동일한 특성을 지닌 EV를 일관되게 재현할 수 있는 생산 및 평가 방법의 개발이 필요하다. 또한 생산 과정에서 다양한 세포 유래 성분이 포함된 불순물을 통제하는 것도 중요하다. 세포에서 생성된 구성 요소 중 EV의 크기는 직경이 약 100nm로 비교적 큰 형태를 가지고 있다. 이에 EV의 분리 분석에서 크기는 하나의 핵심 요소가 될 수 있으며 크기 배제 크로마토그래피가 기여할 수 있는 부분으로 볼 수 있다.

그러나 최종적으로 생산되는 EV의 양은 매우 적고 그 구성요소의 대부분은 지질막이다. 이는 바이오 분석 분야에서 가장 많이 사용되는 검출기인 UV 검출기로 검출을 어렵게 만드는 요소 중 하나이며, 또한 배양된 시료에는 UV 흡광이 높은 생물학적 불순물이 다량 포함이 되어 있어 이는 EV의 모니터링 및 식별을 어렵게 한다.
또한 EV는 세포 유래 성분 중 비교적 크지만 배양된 샘플은 죽은 세포 게놈 유래 염색질 응집체와 같은 다양한 나노 규모 크기 성분의 불순물도 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 크기 배제 방법만을 사용한 분리 및 모니터링은 공정 개발 및 품질 관리에 충분하지 않을 수 있다.

*Target Mocular Range: 100,000 ~ 20,000,000 (H₂O, Pullulan)
**Eluent Variation: MeOH ≦ 75%, ACN ≦ 75%, DMF ≦ 100%, DMSO
Available
***Poresize: 15,000Å(1,500nm)

Exosome을 분리하기 위해 Shodex는 다양한 생물학적 성분 분석에 적합한 친수성 수성 폴리머 기반 SEC 컬럼을 선택했다. OHpak SB-800 HQ 시리즈는 광범위한 분자량 범위, EV를 포함한 대규모 나노스케일 물체까지 포괄적으로 분석이 가능하다. 이 컬럼을 사용하여 Shodex에서는 3개의 서로 다른 검출기를 사용하여 SB-806 HQ 컬럼으로 EV 시료 정제 프로세스의 다면 분석 및 모니터링을 진행했다.
Shodex는 3가지 유형의 샘플을 준비했다.


분석 조건
- Column: Shodex OHpak SB-806 HQ(8.0mm x 300mm, 1ea)
- Eluent: PBS(-) X1 
- Flowrate: 1.0mL/min
- Column Temp: 25℃
- Injection Vol: Sample A 50μL, Sample B 50μL, Sample C 15μL
- Detector:
① UV: Shimadzu SPD-M30 A(280nm) → 배양기 유래 성분 및 일반적인 배양 유래 불순물을 모니터링
② FL: Shimadzu RF-20Axs(Ex 280nm/Em 348nm) → 트립토판 잔기를 지표로 한 단백질을 모니터링
③ LS: Wyatt Dawn 8+(90°rms) → EV 크기 범위에서 더 큰 나노입자를 모니터링


분석 결과
샘플 C의 얻어진 LS 크로마토그램과 추정된 RMS 반경을 기반으로 대상 EV를 포함할 가능성이 가장 높은 부분은 맨 및 크로마토그램의 8분 가량에서 확인할 수 있었다. 반면에 샘플 A와 샘플 B의 UV 및 형광 크로마토그램은 동일한 분획에서 주목할 만한 피크를 확인하지 못하였다. 이 결과는 UV 및 형광 검출기가 목표 EV를 포함하는 부분의 식별에 적합하지 않음을 나타낸다.
반면에 MALS는 EV를 포함한 나노 입자에 대한 높은 감지 감도를 가지고 있다. ① 샘플 A에서 UV 또는 FL에 의해 검출되지 않은 Target fraction의 성분을 검출하였고 ② 시료를 한외여과 및 정제키트를 사용해 농축 및 정제과정을 거치면서 LS 및 RMS의 정밀도에 대한 감도가 증가하였다. ③ 샘플 B 및 C 피크는 대상 구성 요소가 특정 분포를 가지고 있음을 나타낸다.
얻은 MALS 패턴은 EV와 유사한 크기의 농축 불순물이 샘플 B에서도 발견되었음을 보여주었다. 샘플 C를 조제할 때 사용한 정제키트는 이러한 불순물을 효과적으로 감소시켰으며 분석 결과 타겟 EV와 표면 물리적 특성이 다른 것을 확인하였다.
어피니티 정제 키트로 처리된 샘플 C는 UV 및 형광에서 감도가 다른 피크도 검출되었는데 이는 정제 단계 후에도 불순물이 존재함을 나타낸다.

이와 같이 적절한 SEC 컬럼과 MALS를 포함한 서로 다른 검출기의 조합을 사용한다면 연구 개발 및 EV 정제공정을 모니터링하기 위한 효과적인 방법이 될 수 있다.

Showa Denko K.K.의 'Shodex OHpak SB-806 HQ'에 대한 상세한 내용은 Reference(참고자료)를 통하여 확인할 수 있다.

Reference(참고문헌): 1. Kosaka N, Yoshioka Y, Katsuda T, Ono M, Ochiya T. Inflammation and Regeneration 34(5), 233-329 (2014)
2. Tan L, Yeo V, Yang Y, Gagnon P. Analytical and Bioanalytical Chemistry 407, 4173–4181 (2015)
3. Wyatt PJ. Analytica Chimica Acta 272(1), 1-40 (1993)
4. The biology, function, and biomedical applications of exosomes.
   Science 07 Feb 2020: 367, 6478
5. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Rep. 2015;16(1):24-43
6. Creativ Biolabs – Exosome Isolation
7. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics 2017;7(3):789-804

<2022 KOREA LAB 신제품·우수제품 발표 세미나 현장 사진>

Model Name(모델명): Shodex OHpak SB-806 HQ
The Person in Charge(담당자): Shin Yonghun
Maker(제조사): Showa Denko K.K.
Country of Origin(원산지): Japan
Mail inquiry: yhshin@shokokorea.com
Data Services(자료제공): Shodex

<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 9월호에 게재 되었습니다.>

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