개요
본 어플리케이션 노트는 Bio-Rad Giant Panda Problem Kit의 ELISA 구성을 이용하여 간접 ELISA 기반의 상대 정량 예제를 구성하고, MRX A2000 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)에서 표준곡선 작성과 데이터 처리 과정을 확인하기 위해 작성되었다. Giant Panda Problem Kit는 원래 육안 판독을 중심으로 하는 정성 분석 키트이지만, 본시험에서는 1차 항체(Primary Antibody)를 단계적으로 희석하여 표준용액으로 사용하고, 이에 따른 흡광도 변화를 바탕으로 표준곡선을 작성하였다.
본 시험에서 사용한 입력 값 1.000, 0.500, 0.250, 0.125, 0.062, 0.031은 절대 농도가 아니라 1차 항체의 희석 배수에 따른 상대 값이다. 따라서 본 문서는 미지 시료의 절대 농도 산출을 위한 정량 ELISA가 아니라, 희석 배수에 따른 신호 변화와 4-파라미터(4-parameter) 곡선 적용, 표준곡선으로부터 계산된 농도(Back-calculated Concentration), %CV(Coefficient of variation), %RE(Relative error)를 MRX A2000 소프트웨어에서 산출한 결과를 예시 형태로 제시하는 데 목적이 있다.
[그림 1]. 케이랩(K LAB)의 MRX A2000 마이크로플레이트 리더 - 96웰 마이크로플레이트의 흡광도를 측정하고, 표준곡선 작성과 기본적인 ELISA 데이터 분석에 사용할 수 있는 장비.
재료 및 방법
사용 키트 및 시약
본 실험에는 Bio-Rad Giant Panda Problem Kit(Cat. No. 17002878EDU)를 사용하였다. 96웰 플레이트는 키트에 포함된 제품을 사용하였다. 주요 시약은 다음과 같다.
- 10x PBS
- 10% Tween 20
- HRP Enzyme Substrate(TMB)
- Antigen, Chicken Gamma Globulin, lyophilized
- Primary Antibody, Rabbit Anti-Chicken Polyclonal Antibody, lyophilized
- Secondary Antibody, Goat Anti-Rabbit Antibody HRP, lyophilized
동결건조 시약으로 제공되는 항원(Antigen)과 1차 항체, 2차 항체는 모두 1x PBS로 용해 및 희석하여 1x 항원, 1x 1차 항체, 1x 2차 항체 용액을 제조하였다.
완충용액 및 시약 준비
- 1x PBS: 10x PBS를 증류수로 10배 희석하여 준비하였다.
- 세척용 완충액: 1x PBS에 Tween 20을 최종 농도 0.05%가 되도록 첨가하여 제조하였다.
표준용액 준비
1x 1차 항체 용액을 시작 용액(STD01)으로 두고, 1x PBS를 사용해 2배씩 연속 희석하여 STD02 ~ STD06를 준비하였다. 블랭크(Blank)는 1x PBS만 사용하였다. 소프트웨어의 입력 농도는 각각 1.000, 0.500, 0.250, 0.125, 0.062, 0.031로 설정하였다.
간접 ELISA 절차
본 키트는 신속 교육용 키트로, 아래 모든 반응은 통상적인 ELISA보다 짧은 반응 시간으로 구성하였다.
- 항원 코팅: 96웰 플레이트의 사용 웰에 1x 항원 용액을 웰당 50 μL씩 분주하였다. 실온에서 약 5분간 반응시킨 후, 세척용 완충액으로 3회 세척하였다.
- 1차 항체 반응: 각 웰에 블랭크와 STD01 ~ STD06 용액을 웰 당 50 μL씩 분주하였다. 실온에서 약 5분간 반응시킨 후, 세척용 완충액으로 3회 세척하였다.
- 2차 항체 및 TMB 반응: 1x 2차 항체 용액을 웰당 50 μL씩 분주하여 실온에서 약 5분간 반응시킨 후, 세척용 완충액으로 3회 세척하였다. 이후 TMB 기질용액을 웰당 50 μL씩 분주한 뒤, MRX A20c00에서 측정하였다.
[그림 2]. Giant Panda Problem Kit를 이용한 간접 ELISA 반응 플레이트 예시 – 상대 값이 높은 웰일수록 진한 청색, 낮은 웰과 블랭크에 가까울수록 연한 발색을 나타낸다.
흡광도 측정 및 데이터 처리
발색이 완료된 플레이트는 MRX A2000에서 Endpoint 모드로, 655 nm 파장에서 측정하였다. 소프트웨어의 레이아웃 편집기에서 블랭크와 STD01 ~ STD06를 각 2회 반복으로 지정하고, 4-파라미터 곡선을 적용하여 표준곡선을 작성하였다.
각 표준용액에 대해서는 표준곡선으로부터 계산된 농도, 표준편차, %CV, %RE가 자동 계산되도록 설정하였다.
결과
MRX A2000 소프트웨어에서 4-파라미터 곡선을 적용한 결과, 결정계수(R²)는 0.9977로 계산되었다. 표 1에는 STD01 ~ STD06의 입력 농도, 표준곡선으로부터 계산된 농도, 평균 흡광도, %CV 및 %RE를 정리하였다.
STD01 ~ STD05에 대해, 입력 값 1.000, 0.500, 0.250, 0.125, 0.062에서 %CV는 0.603 ~ 6.104 범위였고, %RE는 -12.400 ~ 12.661 범위로 계산되었다. STD06에서는 두 반복 측정 중 한 웰의 계산 농도가 “< 0.030”으로 표시되고, 이에 따라 STD06에 대한 평균 농도, %CV, %RE가 N/A로 처리되었다.
이러한 결과는 MRX A2000 소프트웨어에서 생성된 표준곡선 그래프[그림 3]와 표준 데이터 요약 화면[그림 4]에서 확인할 수 있다.
[표 1]. 표준용액(STD01 ~ STD06)의 요약 결과
[그림 3]. MRX 소프트웨어에서 생성된 표준곡선과 4 - 파라미터 곡선 적용 결과 화면 - 각 표준용액(STD01~STD06)의 흡광도 값으로부터 4-파라미터 곡선이 작성되며, 곡선 수식과 A, B, C, D값, 95% 신뢰구간(95% CI)이 함께 표시된다.
[그림 4]. MRX 소프트웨어의 표준 데이터 요약 화면 – 각 표준용액(STD01 ~ STD06)에 대해 입력 값, 표준곡선으로부터 계산된 농도, 평균 흡광도, 표준편차, 변동계수(%CV), %RE가 표 형태로 표시된다.
결론
MRX A2000 마이크로플레이트 리더와 소프트웨어는 본 예제와 같이 간접 ELISA 형식으로 구성한 실험에서 표준곡선 작성과 결과 보고에 필요한 데이터 처리 기능을 제공하였다. 이를 통해 각 표준용액에 대해 표준곡선으로부터 계산된 농도, %CV, %RE가 산출된 결과를 한 화면에서 확인할 수 있다.
‘간접 ELISA를 이용한 상대 정량 분석 예제 및 MRX A2000 마이크로플레이트 리더의 적용’에 관한 궁금한 내용은 본 원고 자료를 제공한 케이랩(주)을 통하여 확인 가능하다.
Reference(참고문헌): Bio-Rad Laboratories. Giant Panda Problem Kit for AP Biology: A ThINQ! Investigation. AP Biology Instructor’s Guide. Catalog #17002878EDU. Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA.
Model Name(모델명): MRX A2000 Microplate Reader
The Person in Charge(담당자): Ji－su Kim
Maker(제조사): K LAB
Country of Origin(원산지): Korea
e-mail: mint5135@klab.im
Data Services(자료제공): K LAB
<이 기사는 사이언스21 매거진 2026년 8월호에 게재 되었습니다.>
[그림 1]. 케이랩(K LAB)의 MRX A2000 마이크로플레이트 리더 - 96웰 마이크로플레이트의 흡광도를 측정하고, 표준곡선 작성과 기본적인 ELISA 데이터 분석에 사용할 수 있는 장비.재료 및 방법사용 키트 및 시약본 실험에는 Bio-Rad Giant Panda Problem Kit(Cat. No. 17002878EDU)를 사용하였다. 96웰 플레이트는 키트에 포함된 제품을 사용하였다. 주요 시약은 다음과 같다.- 10x PBS- 10% Tween 20- HRP Enzyme Substrate(TMB)- Antigen, Chicken Gamma Globulin, lyophilized- Primary Antibody, Rabbit Anti-Chicken Polyclonal Antibody, lyophilized- Secondary Antibody, Goat Anti-Rabbit Antibody HRP, lyophilized동결건조 시약으로 제공되는 항원(Antigen)과 1차 항체, 2차 항체는 모두 1x PBS로 용해 및 희석하여 1x 항원, 1x 1차 항체, 1x 2차 항체 용액을 제조하였다.완충용액 및 시약 준비- 1x PBS: 10x PBS를 증류수로 10배 희석하여 준비하였다.- 세척용 완충액: 1x PBS에 Tween 20을 최종 농도 0.05%가 되도록 첨가하여 제조하였다.표준용액 준비1x 1차 항체 용액을 시작 용액(STD01)으로 두고, 1x PBS를 사용해 2배씩 연속 희석하여 STD02 ~ STD06를 준비하였다. 블랭크(Blank)는 1x PBS만 사용하였다. 소프트웨어의 입력 농도는 각각 1.000, 0.500, 0.250, 0.125, 0.062, 0.031로 설정하였다.간접 ELISA 절차본 키트는 신속 교육용 키트로, 아래 모든 반응은 통상적인 ELISA보다 짧은 반응 시간으로 구성하였다.- 항원 코팅: 96웰 플레이트의 사용 웰에 1x 항원 용액을 웰당 50 μL씩 분주하였다. 실온에서 약 5분간 반응시킨 후, 세척용 완충액으로 3회 세척하였다.- 1차 항체 반응: 각 웰에 블랭크와 STD01 ~ STD06 용액을 웰 당 50 μL씩 분주하였다. 실온에서 약 5분간 반응시킨 후, 세척용 완충액으로 3회 세척하였다.- 2차 항체 및 TMB 반응: 1x 2차 항체 용액을 웰당 50 μL씩 분주하여 실온에서 약 5분간 반응시킨 후, 세척용 완충액으로 3회 세척하였다. 이후 TMB 기질용액을 웰당 50 μL씩 분주한 뒤, MRX A20c00에서 측정하였다.
[그림 2]. Giant Panda Problem Kit를 이용한 간접 ELISA 반응 플레이트 예시 – 상대 값이 높은 웰일수록 진한 청색, 낮은 웰과 블랭크에 가까울수록 연한 발색을 나타낸다.흡광도 측정 및 데이터 처리발색이 완료된 플레이트는 MRX A2000에서 Endpoint 모드로, 655 nm 파장에서 측정하였다. 소프트웨어의 레이아웃 편집기에서 블랭크와 STD01 ~ STD06를 각 2회 반복으로 지정하고, 4-파라미터 곡선을 적용하여 표준곡선을 작성하였다.각 표준용액에 대해서는 표준곡선으로부터 계산된 농도, 표준편차, %CV, %RE가 자동 계산되도록 설정하였다.결과MRX A2000 소프트웨어에서 4-파라미터 곡선을 적용한 결과, 결정계수(R²)는 0.9977로 계산되었다. 표 1에는 STD01 ~ STD06의 입력 농도, 표준곡선으로부터 계산된 농도, 평균 흡광도, %CV 및 %RE를 정리하였다.STD01 ~ STD05에 대해, 입력 값 1.000, 0.500, 0.250, 0.125, 0.062에서 %CV는 0.603 ~ 6.104 범위였고, %RE는 -12.400 ~ 12.661 범위로 계산되었다. STD06에서는 두 반복 측정 중 한 웰의 계산 농도가 “< 0.030”으로 표시되고, 이에 따라 STD06에 대한 평균 농도, %CV, %RE가 N/A로 처리되었다.이러한 결과는 MRX A2000 소프트웨어에서 생성된 표준곡선 그래프[그림 3]와 표준 데이터 요약 화면[그림 4]에서 확인할 수 있다.[표 1]. 표준용액(STD01 ~ STD06)의 요약 결과
[그림 3]. MRX 소프트웨어에서 생성된 표준곡선과 4 - 파라미터 곡선 적용 결과 화면 - 각 표준용액(STD01~STD06)의 흡광도 값으로부터 4-파라미터 곡선이 작성되며, 곡선 수식과 A, B, C, D값, 95% 신뢰구간(95% CI)이 함께 표시된다.
[그림 4]. MRX 소프트웨어의 표준 데이터 요약 화면 – 각 표준용액(STD01 ~ STD06)에 대해 입력 값, 표준곡선으로부터 계산된 농도, 평균 흡광도, 표준편차, 변동계수(%CV), %RE가 표 형태로 표시된다.결론MRX A2000 마이크로플레이트 리더와 소프트웨어는 본 예제와 같이 간접 ELISA 형식으로 구성한 실험에서 표준곡선 작성과 결과 보고에 필요한 데이터 처리 기능을 제공하였다. 이를 통해 각 표준용액에 대해 표준곡선으로부터 계산된 농도, %CV, %RE가 산출된 결과를 한 화면에서 확인할 수 있다.‘간접 ELISA를 이용한 상대 정량 분석 예제 및 MRX A2000 마이크로플레이트 리더의 적용’에 관한 궁금한 내용은 본 원고 자료를 제공한 케이랩(주)을 통하여 확인 가능하다.Reference(참고문헌): Bio-Rad Laboratories. Giant Panda Problem Kit for AP Biology: A ThINQ! Investigation. AP Biology Instructor’s Guide. Catalog #17002878EDU. Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA.Model Name(모델명): MRX A2000 Microplate ReaderThe Person in Charge(담당자): Ji－su KimMaker(제조사): K LABCountry of Origin(원산지): Koreae-mail: mint5135@klab.imData Services(자료제공): K LAB<이 기사는 사이언스21 매거진 2026년 8월호에 게재 되었습니다.>